Nature关注：驰援武汉的德国病毒学教授Rolf Hilgenfeld是什么来头

近日，德国吕贝克大学的顶级研究员、结构生物学家Rolf Hilgenfeld教授带着实验室冠状病毒抑制剂研究成果抵达中国。Rolf Hilgenfeld是冠状病毒和流行性呼吸道疾病研究领域的专家，自从SARS爆发以来，结构生物学家Rolf Hilgenfeld首次解析了SARS的3D结构并一直在进行冠状病毒等病原微生物的研究。

图1 为帮助中国制止新病毒的传播，一位结构生物学家前往疫情中心（1月24日，图片来源https://www.nature.com/articles/d41586-020-00190-6）

图2 结构生物学家Rolf Hilgenfeld（希尔根费尔德）教授。（图片来源：Nature）

图3 形似皇冠的冠状病毒。（图片来源：Nature）

在Nature 杂志对 Rolf Hilgenfeld 教授的报道中，Hilgenfeld表明希望与武汉的研究人员合作进行两种药物的测试以期应对新型冠状病毒的感染。

Hilgenfeld团队开发出了既对冠状病毒又对肠病毒具有活性的第二代抑制剂，对包括人类鼻病毒（普通感冒的主因）和手足口病等证实有效。它们针对病毒蛋白酶，在冠状病毒和肠病毒中均具有共同特征，具有广谱性。

那么，大佬Rolf Hilgenfeld在冠状病毒以及其他病原微生物方面做过什么厉害的研究呢？

1. 2019年biorxiv预印本：Processing of the SARS-CoV pp1a/ab nsp7-10 region（SARS-CoV 病毒pp1a/abnsp7-10的加工过程，DOI:10.1101/860049）

分析了严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（SARS-CoV）非结构蛋白nsp复合体形成过程，揭示病毒多蛋白的加工动态和蛋白相互作用的情况。冠状病毒SARS-CoV复制/转录复合物（RTC）的形成过程的基本步骤包括主要蛋白酶M-pro对保守的多蛋白nsp7-10区进行加工以及随后释放等，提供了对SARS-CoV蛋白互作的新见解，有利于抗病毒药物的开发.

图4 （图片来源：biorxiv）

2. 2016年Nature Communications：Irreversible inhibitors of the 3C protease of Coxsackie virus through templated assembly of protein-binding fragments（柯萨奇病毒3C蛋白酶的不可逆抑制剂通过蛋白质结合片段的模板化组装，DOI:10.1038/ncomms12761）

与生物大分子结合的小分子片段可以作为药物开发的起点，作者提出一种策略，通过潜在的蛋白质结合片段来诱导共价结合的不可逆酶抑制剂的靶标指导形成，并以柯萨奇病毒B3 3C蛋白酶进行了演示，它是一种针对肠病毒感染的药理靶标，最后验证了活性片段组合效果，并提供了有效的肠病毒蛋白酶的非肽作为潜在广谱抑制剂。

图5 具有EV-B93的3C蛋白酶的抑制剂14的晶体结构（图片来源：NC）。

3. 2016年PNAS：p53 down-regulates SARS coronavirus replication and is targeted by the SARS-unique domain and PLpro via E3 ubiquitin ligase RCHY1（p53抑制SARS冠状病毒复制，而SARS独特域和PL-pro通过E3泛素连接酶RCHY1 靶向p53，https://www.pnas.org/content/113/35/E5192）

揭示了SARS-CoV会主动抑制宿主抗病毒因子p53对病毒复制的限制。SARS-CoV非结构蛋白之一木瓜蛋白酶样蛋白酶，能与E3泛素连接酶RCHY1 互作降解p53，而SARS特异域（SUD）会增强这些效果。

图6  SUD在与RCHY1相互作用（图片来源：PNAS）

4. 2015年Journal of Molecular Biology：Structures of DegQ from Legionella pneumophila Define Distinct ON and OFF States（嗜肺军团菌DegQ的结构决定开关状态，DOI: 10.1016/j.jmb.2015.06.023）

HtrA家族蛋白在细菌周质中的蛋白质质量控制过程中起着重要作用。HtrA蛋白都组装成通常由3至24个单体组成的复杂寡聚物，从而可以严格调节蛋白水解活性。分析表明，来自嗜肺军团菌的DegQ的蛋白水解活性及高阶复合物的组装是由底物衍生肽的结合触发的。肽与PDZ1结构域的结合对于蛋白水解活性至关重要，此外与蛋白水解活性相反，DegQ的伴侣功能不受激活级联状态的影响。

5. 2013年Journal of Biological Chemistry：Helix Unfolding/Refolding Characterizes the Functional Dynamics of Staphylococcus aureus Clp Protease（螺旋展开/重新折叠表征金黄色葡萄球菌Clp蛋白酶的功能动力学，DOI:10.1074/jbc.M113.452714）

ATP依赖性Clp蛋白酶（ClpP）在在细菌病原体毒力的调节中都起着至关重要的作用，使其成为抗菌治疗的潜在靶标。此项研究为ClpP的功能构象变化的动力学和机理提供了分子见解，确定了Ala140残基在伸展状态和压缩状态之间的过渡过程中充当了“铰链”，而Glu137对于稳定压缩状态至关重要，这反映了整个ClpP家族共有的动态过程的转换机制，从而有助于更好地了解Clp蛋白酶组装和功能的原理。

6. 2011年PLoS Pathog：The SARS-Coronavirus-Host Interactome: Identification of Cyclophilins as Target for Pan-Coronavirus Inhibitors（SARS冠状病毒-宿主互作分析显示亲环蛋白为潜在冠状病毒广谱抑制剂，https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002331）

作者筛选鉴定了几种免疫菌素作为CoV非结构蛋白1（Nsp1）的潜在互作分子。这些分子调节钙调神经磷酸酶/ NFAT途径，在免疫细胞活化中起重要作用。环孢菌素A（CspA）对亲环蛋白的抑制作用会阻止冠状病毒属的增殖。此外CspA的非免疫抑制衍生物可作为广谱CoV抑制剂，适用于新兴CoV病毒以及人畜共患病病原体。

图7  SARS-CoV和病毒宿主蛋白相互作用的相互作用网络

7. 2008年Cell子刊：A Structural View of the Inactivation of the SARS Coronavirus Main Proteinase by Benzotriazole Esters（苯并三唑酯使SARS冠状病毒主要蛋白酶失活的结构分析，https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2008.04.011）

SARS冠状病毒的主蛋白酶（M-pro）是抗冠状病毒药物的靶点，苯并三唑酯是该酶的有效非肽类抑制剂。作者分析了活性部位的半胱氨酸已被抑制剂苯并三唑酯酰化的SARS-CoVM-pro晶体结构。对通过修饰抑制剂占据S1和S2特异性口袋的取代基以提高其效力和特异性。此外，苯甲酰基部分中的供电子取代基可用于稳定具有活性位的半胱氨酸的硫酯键，以防止水解。

图8 与苯并三唑反应的SARS-CoV M-pro关键位点（图片来源：Cell Press）

8. 2009年7月 PLoS Pathogens：The SARS-Unique Domain (SUD) of SARS coronavirus contains two macrodomains that bind G-quadruplexes（SARS冠状病毒的SARS特异域包含两个与G四联体结合的宏结构域，DOI:10.1371/journal.ppat.1000428）

SARS冠状病毒的非结构蛋白Nsp3（1922个氨基酸残基）中，SARS特异域（SUD）仅在SARS-CoV和某些蝙蝠中发现的高度相关的病毒中发现，它可能与SARS-CoV的极端致病性有关。分析发现SUD无法结合ADP-核糖，且SUD与已知形成G-四链体的寡核苷酸相互作用。SUD可能参与结合具有这种特殊结构的病毒或宿主细胞RNA，从而调节病毒复制或抵抗被感染宿主细胞的免疫反应。

图9  SUD核心二聚体的结构。（图片来源：PLoS Pathogens）

9 . 2003年PNAS：The crystal structures of severe acute respiratory syndrome virus main protease andits complex with an inhibitor（重症急性呼吸综合征病毒主要蛋白酶的晶体结构及其与抑制剂的复合体，DOI:10.1073/pnas.1835675100）

首次报告了SARS-CoV主蛋白酶在不同pH值下与特定抑制剂复合的晶体结构，揭示出活性位点构象及大量的pH依赖性构象变化，解释了M-pro在不同pH值下活性的变化。另外，底物-类似物抑制剂复合物的结构显示出抑制剂结合的意外模式，并为合理的药物设计提供了结构基础。

图10  SARS-CoV M pro二聚体结构与底物类似物六肽基CMK抑制剂复合体（图片来源：PNAS）

10 . 2003年Science：Coronavirus Main Proteinase (3CLpro) Structure: Basis for Design of Anti-SARS Drugs（冠状病毒主要蛋白酶3CL-pro的结构是抗SARS药物设计的基础，https://science.sciencemag.org/content/300/5626/1763）

图11

作者确定了人类冠状病毒（菌株229E）M-pro和猪冠状病毒（TGEV）]M-pro抑制剂复合体的晶体结构，TGEV M-pro与六肽基CMK配合形成的晶体结构揭示了底物与肽类抑制剂的结合方式。控制冠状病毒复制复合物活性的病毒主蛋白酶（M-pro）是潜在治疗靶标。分析表明，鼻病毒3C-pro抑制剂修饰后用于治疗SARS。

图12 TGEV M结合的六肽基CMK抑制剂（红色）的精细模型，抑制剂以相同的方式与不同的冠状病毒M-pro结合。（图片来源：Science）

参考材料：https://www.researchgate.net/profile/Rolf_Hilgenfeld/publications

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